主办单位：南京工业大学
协办单位：中国生物工程学会
协办单位：中国化工学会生物化工专业委员会
ISSN：-CN：32-/Q
群感效应在金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌群体增殖中的作用
徐振波1，2，刘子奇1，谢金红1，刘君彦1
(1.华南理工大学食品科学与工程学院；2.马里兰大学微生物病理系)
摘要
群感效应（quorumsensing，QS）是指微生物细胞通过感应细胞外信号分子的浓度从而感知菌群密度的大小，并依赖信号分子的浓度来调控基因表达的一种交流机制。金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，S.aureus）与铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa，P.aeruginosa）分别是革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中典型的食源性致病菌，二者的QS系统在不同情况下的群体增殖中表现出竞争和协同作用，与毒素分泌、耐药性及被膜形成相关。本文中，笔者分别介绍了金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的群感效应系统，并概述了群感效应在两种微生物群体增殖中的作用，由于多种微生物种间关系调控和交流机制较为复杂，对两种微生物群体增殖特性和相互作用机制有待进一步研究。
群感效应（QS）是微生物通过感知自体诱导物的浓度来调节相关基因表达的一种作用机制，也是微生物间进行相互交流一种通讯方式。金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性菌，广泛存在于空气、土壤、水源、人和动物体内，在我国，约有20%～25%的食物中毒由金黄色葡萄球菌引起，仅次于沙门氏菌和副溶血性弧菌。铜绿假单胞菌属于非发酵革兰氏阴性菌，广泛存在于湿润环境，尽管铜绿假单胞菌不作为食品微生物检测的常规指标项目，但已经被确认为食源性和水源性致病微生物。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌已被证实可以共同污染水源以及肉制品、乳制品等食品行业，多微生物相互作用成为食品行业的巨大隐患。QS不仅有助于细菌间相互交流和种群密度调控，而且在维持细菌对人类等其他宿主的致病性方面也发挥着重要作用。为了治理金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌引起的混合污染，必须先了解两者的群体增殖特性和相互作用机制。
1金黄色葡萄球菌群感效应系统
在金黄色葡萄球菌中至少有两个QS系统，分别为agr（theaccessorygeneregulator，agr）系统（图1）和LuxS/AI-2系统。agr系统是革兰氏阳性菌中典型的QS系统，也是金黄色葡萄球菌中起到主导地位的QS系统，而LuxS/AI-2系统在革兰氏阴性菌和阳性菌中均广泛存在，在金黄色葡萄球菌中和主要的群体感应一起共同参与基因的调控。
图1金黄色葡萄球菌QSagr系统示意图
Fig.1S.aureusquorumsensingagrsystemmodel
通常在指数期后期，随着种群密度增加，金黄色葡萄球菌中信号分子自体诱导肽（AIP）不断积累，agr系统被诱导。根据AIP不同，agr主要分为I-IV基因型。AIP与位于细胞膜上的受体蛋白结合后，通过受体蛋白与其他蛋白作用调控种群密度、胞外物质和毒素分泌等相关基因的表达。P2和P3是agr系统中的两个反向启动子，分别调控RNAII和RNAIII的转录。RNAII编码区由agrA、B、C和D四个基因组成。agrD与AIP前体的合成有关，而后由agrB编码细胞膜上的跨膜肽链内切酶对AIP前体进行诱导、修饰和转运。agrC和agrA编码的AgrC（转膜受体组氨酸激酶）和AgrA（细胞质调控子）组成二元传导系统，AIP结合到传感器AgrC促使AgrA磷酸化后，与P2和P3启动子结合调节RNAII和RNAIII表达。RNAIII是调控靶基因表达的重要分子，目前RNAIII已被证实可以抑制多种表面蛋白的表达，如葡萄球菌表面蛋白A（SpA）、纤维连结蛋白A和蛋白B（FnBPAandFnBPB），也可以促进多种毒力蛋白的表达，如δ-溶血素（Hld）、α-溶血素（Hla）、杀白细胞素（PVL）等。
2铜绿假单胞菌群感效应系统
在铜绿假单胞菌中主要有四个QS系统，分别是LasI/LasR系统、RhlI/RhlR系统、喹诺酮类信号（PQS）系统和集成群体感应信号（IQS）系统。LasI/LasR系统和RhlI/RhlR系统属于革兰氏阴性菌中的LuxI/LuxR系统，其信号分子是高丝氨酸内脂（AHL）。lasI和lasR分别编码高丝氨酸内脂同系物OdDHL（N-(3-oxododecanoyl)-homoserinelactone）及其转录激活因子，rhlI和rhlR则负责编码BHL（N-butyrylhomoserinelactone）合成酶及其转录激活因子。当信号分子随菌群数量累积到阈值时，LasR-OdDHL和RhlR-BHL二聚体结合到保守的las-rhl区域从而启动下游毒素蛋白表达。目前已知有蛋白酶（lasB、lasA、aprA）、外毒素A（toxA）、绿脓菌素（phzABCDEFG）、鼠李糖脂（rhlAB）、凝集素（lecA）和氢氰酸（hcnABC）等毒素因子受LasI/LasR系统和RhlI/RhlR系统调控。
PQS系统的信号分子是2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮（PQS），pqs操纵子（pqsABCD）、phnAB和pqsH共同参与了PQS的合成。首先PqsA活化邻氨基苯甲酸形成邻氨基苯酰-辅酶A，随后邻氨基苯甲酸在PqsBCD作用下转化为PQS的前体2-庚基-4-喹诺酮（2-heptyl-4-quinolone,HHQ）。HHQ可以在PqsH作用下转化为PQS，也可以在PqsL作用下转化为N-氧化物，以4-羟基-2-庚喹诺酮-N-氧化物（4-hydroxy-2-heptylquinoline-N-oxide,HQNO）最为常见（图2）。目前已知绿脓菌素（phzABCDEFG）、弹性蛋白酶（lasB）、PA-IL凝集素（lecA）和鼠李糖脂（rhlAB）、氢氰酸等毒素的生成与PQS系统的控制有关
图2喹诺酮类QS系统信号分子合成示意图
Fig.2Thesignalmoleculesinquinolonesignalssystem
IQS系统的信号分子由abmBCDE基因簇编码产生，当IQS与对应的受体IqsR结合时，启动IQS系统。抗代谢物L-2-氨基-4-甲氧基-反式-3-丁烯酸（AMB）的合成与IQS系统有关，通过敲除ambB、PQS合酶基因pqsA或C4HSL合酶基因rhlI后，只能分别通过添加PQS和C4HSL来恢复ΔpqsA和ΔrhlI中的AMB的合成，而不能通过添加IQS来恢复。这些发现表明，AMB的生物合成受IQS通过RhlI/RhlR系统和PQS系统的调控，这与其他毒力特性（如产黄素）相似。该系统不仅可以监测细菌种群密度，而且还可以承载磷酸盐限制的胁迫。
铜绿假单胞菌的QS系统相互作用，形成了复杂而精细的级联调控关系（图3）。LasI/LasR系统位于级联调控系统的顶端，在铜绿假单胞菌种群数量达到阈值时，形成的LasR-OdDHL复合物能激发RhlI/RhlR系统和PQS系统，从而显现出逐步激活层级系统的特点。RhlI/RhlR系统和PQS系统受LasI/LasR系统调控的同时，也存在相互调控，PQS系统促进RhlI/RhlR系统表达，但PQS的合成受RhlI/RhlR系统抑制。RhlR-BHL复合物不仅能正调控其本身，同时能反过来正调控LasI/LasR系统。PQS系统对LasI/LasR系统的表达也有促进作用。IQS系统上连LasI/LasR系统，下接RhlI/RhlR及PQS系统。正常状态下，IQS系统受LasI/LasR系统紧密调控，但当细菌处于磷酸盐缺乏的环境中时，IQS系统被激活，部分代替LasI/LasR系统的功能来调节毒力因子的产生。IQS系统生物合成的中断会使RhlI/RhlR及PQS系统麻痹，并减弱细菌的毒力。
图3铜绿假单胞菌层级QS系统
Fig.3Schematicrepresentationofthe
fourQSsignalingnetworksinP.aeruginosa
3金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌群体增殖中的群感效应
3.1群感效应在群体增殖中的竞争作用
在竞争关系中，铜绿假单胞菌PQS系统的信号分子HQNO和次级代谢产物绿脓菌素都具有抑制金黄色葡萄球菌的有氧呼吸和抑制其生长的作用。在混合培养过程中，金黄色葡萄球菌通过产生小菌落突变株（SCVs）来增加自身生存的可能性。SCV对万古霉素具有一定抗性，所以纯化的HQNO能保护金黄色葡萄球菌免受万古霉素的抗菌作用。铜绿假单胞菌的另一竞争机制是裂解金黄色葡萄球菌，同时铜绿假单胞菌很可能把裂解的金黄色葡萄球菌细胞释放的含铁蛋白质作为铁的来源。金黄色葡萄球菌细胞壁的重要成分五甘氨酸可被铜绿假单胞菌分泌LasA蛋白酶降解。尽管HQNO和LasA均存在于铜绿假单胞菌上清液中，但大多数实验结果表明铜绿假单胞菌在体外能增强抗生素对金黄色葡萄球菌的作用，这可能是因为LasA的增强作用强于HQNO的保护作用。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的竞争作用还体现在生物被膜的形成过程中。Gabriel等通过基因表达分析表明，当金黄色葡萄球菌暴露于HQNO时会激活SigB，从而导致纤连蛋白结合蛋白A的合成和与生物被膜形成相关的sarA基因表达增加，相反，金黄色葡萄球菌的agr系统和α-溶血素基因被HQNO抑制。
3.2群感效应在群体增殖中的协同作用
铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌混合培养过程中，在毒素分泌、耐药性和对抗宿主免疫系统等方面存在协同作用。乙酰葡萄糖胺大量存在在革兰氏阳性菌细胞壁中，能诱导铜绿假单胞菌PQS系统产生绿脓菌素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂和HQNO等相关毒素。肽聚糖是构成革兰氏阳性菌细胞壁的主要成分，在果蝇和大蜡蛾感染模型中，可以诱导铜绿假单胞菌产生相关的毒素因子。铜绿假单胞菌分泌的蛋白酶、鼠李糖脂、外毒素和吩嗪类物质已被证实与金黄色葡萄球菌分泌的QS因子AI-2有关，此种诱导效应在果蝇和大蜡蛾感染模型的体外和体内实验均被观察到。通过构建突变株表明，HQNO和绿脓菌素能保护金黄色葡萄球菌免受细胞壁和蛋白质的抗生素抑制作用，从而增加金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药性。因此，微生物的种间交流作用对生物被膜的耐药性存在广泛影响。由于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌之间的协同作用，为其混合感染的治理提出了难题，了解QS在微生物群体增殖中的协同作用，或许为多微生物的治理提供有效的解决思路。
4总结与展望
QS系统与食源性致病微生物的毒素分泌、耐药性、对抗宿主免疫系统及被膜形成等特性的表达密切相关，已经有大量研究者致力于细菌QS的研究。与单一微生物相比，生活中更为常见的是由多微生物共同引起的食品污染，给人类健康和食品安全带来极大隐患。本文中，笔者以金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌群体作为研究对象，概述了二者的QS系统并总结了QS在群体增殖中的竞争和协同作用，有别于前人仅侧重于某一微生物在群体中受到QS调控的影响。深入了解QS在两种微生物群体增殖中的作用是治理金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌混合污染的关键，但由于多种微生物种间关系调控和交流机制较为复杂，对群体增殖特性和相互作用机制有待进一步研究，为治理多微生物混合污染提供有力的理论支持。
第一作者：徐振波
全国百篇优秀博士学位论文作者（年），广东省高层次人才特殊支持计划科技创新青年拔尖人才（年），广州市珠江科技新星（年）。长期致力于食源性微生物安全，领域包括微生物致病性、耐药性与群体效应、组学与生物信息学、快速检测与传感器技术等，在国际上享有一定知名度，为国际MarkShirtliff微生物被膜基金会（
本文编辑：佚名
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